การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของโปรติเอสที่ผลิตโดยแบคทีเรียชอบเค็ม Halobacillus trueperi subspecies thailandensis

Abstract

การคัดเลือกแบคทีเรียที่ผลิตโปรติเอสในอาหารแข็งสูตรมีเดียม 73 ที่มี 20 เปอร์เซ็นต์ โซเดียมคลอไรด์ และพีเอช 5.5 จาก 45 ไอโซเลต โดยใช้บรรทัดฐานการมีค่าอัตราส่วนสูงที่สุด ระหว่างเส้นผ่านศูนย์กลางวงใสต่อเส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนี พบไอโซเลต SA.02 ซึ่งแยกจากเกลือสมุทรที่ใช้ในการผลิตซีอิ๊วระดับห้องปฏิบัติการ มีอัตราส่วนดังกล่าวสูงที่สุด และเพิ่มจำนวนเซลล์ได้ดีในอาหารสูตรมีเดียม 73 ที่มี 5-10 เปอร์เซ็นต์ โซเดียมคลอไรด์ ผลการจำแนกชนิดไอโซเลต SA.02 พบว่ารูปร่างเซลล์เป็นแท่ง ติดสีแกรมบวก มีสปอร์ ชนิดของแฟลกเจลาแบบเพอริไทรคัส เพิ่มจำนวนเซลล์เฉพาะในที่มีอากาศ และทดสอบด้านชีวเคมี รวมถึงหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S rDNA พบว่าไอโซเลต SA.02 มีลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S rDNA คล้ายกับลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S rDNA ของ Halobacillus trueperi 99 เปอร์เซ็นต์ ทดสอบด้านชีวเคมีเพิ่มเติม เพื่อเปรียบเทียบความเหมือนกันระหว่างไอโซเลต SA.02 กับ Halobacillus trueperi และ Halobacillus thailandensis พบว่ามีผลการทดสอบทางชีวเคมีคล้ายกับ Halobacillus trueperi มากกว่าคล้ายกับ Halobacillus thailandensis จึงสรุปผลการทดลองว่า ไอโซเลต SA.02 อาจเป็น subspecies หนึ่งของ Halobacillus trueperi งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกที่พบ Halobacillus sp. ในเกลือสมุทร ผลการทำโปรติเอสจาก Halobacillus trueperi subspecies thailandensis ให้บริสุทธิ์ พบว่าแบคทีเรียนี้ขับโปรติเอสแอคติวิตีสูงสุด (65.6 ยูนิตต่อมิลลิลิตร) ในอาหารสูตรมีเดียม 73 สูตรปรับปรุงที่มีสารสกัดจากยีสต์เพิ่มขึ้นเป็น 1.5 กรัมต่อลิตร ที่มี 5 เปอร์เซ็นต์ โซเดียมคลอไรด์ ทำโปรติเอสให้บริสุทธิ์โดยตกตะกอนด้วย 0-50 เปอร์เซ็นต์ แอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว และการทำดีอีเออี ไบโอ-เจล เอ, เซฟาเดกซ์ จี-50 เจลฟิวเตรชัน และ SDS-PAGE คู่กับการย้ายแถบโปรตีนจาก SDS-PAGE เจลไปยัง ซับสเตรต-PAGE เจล พบว่า สามารถทำโปรติเอสให้บริสุทธิ์ขึ้น 1.5 เท่า แต่มีร้อยละการตรวจพบแอคติวิตีเหลือเพียง 0.25 โปรติเอสมีน้ำหนักโมเลกุล 31 กิโลดาลตัน พบว่า 5 มิลลิโมลาร์ EDTA ยับยั้งการทำงานของโปรติเอสเกือบ 100 เปอร์เซ็นต์ จึงจัดเป็น metalloprotease