การแสดงออกและลักษณะสมบัติของฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนก (H5N1) ใน Pichia pastoris

Abstract

เชื้อไวรัสไข้หวัดนกสายพันธุ์ H5N1 เป็นเชื้อไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคไข้หวัดใหญ่ในสัตว์ปีก ซึ่งเป็นโรคที่แพร่กระจายอย่างรวดเร็ว และเป็นสาเหตุให้เกิดความเสียหายทางด้านเศรษฐกิจและสาธารณสุข โปรตีนฮีมแอกกลูทินินเป็นโปรตีนที่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อวงจรชีวิตของไวรัส เพราะฮีมแอกกลูทินินเป็นโปรตีนที่จะจับกับตัวรับของเซลล์เจ้าบ้าน ทำให้เข้าสู่เซลล์และเกิดการจำลองตัวเองได้ นอกจากนี้โปรตีนดังกล่าวถูกใช้ในการจัดจำแนกความรุนแรงของสายพันธุ์ของเชื้อไวรัส วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ โคลน แสดงออก และศึกษาสมบัติของโปรตีนฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนก (H5N1) ในยีสต์ Pichia pastoris ในการศึกษาครั้งนี้ได้นำยีนฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนกจำนวน 3 สายพันธุ์ โดยเป็นสายพันธุ์ที่มีความรุนแรงในการก่อโรคสูง 2 สายพันธุ์และสายพันธุ์ที่มีความรุนแรงในการก่อโรคต่ำ 1 สายพันธุ์ มาเชื่อมเข้ากับเวกเตอร์แสดงออก pPICZαA เพื่อแสดงออกใน P. pastoris KM71 ผลการทดลองพบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม แสดงออกภายในเซลล์ยีสต์ ขณะชักนำด้วย 4%(v/v) เมทานอล เป็นเวลา 2 วัน เมื่อวิเคราะห์ด้วย Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) และ western blotting รีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม มีขนาดประมาณ 95 กิโลดาลตัน และเกิดแถบโปรตีนขนาดเล็ก ซึ่งอาจเกิดจากการถูกย่อยด้วยเอนไซม์โปรติเอสภายในเซลล์ยีสต์ เมื่อนำรีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม ไปทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ Diethylaminoethyl cellulose (DEAE column) และนำไปศึกษาสมบัติของโปรตีน พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสามที่บริสุทธิ์บางส่วน สามารถเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดงได้ และเมื่อนำไปทำให้บริสุทธิ์ต่อด้วยคอลัมน์ Sephacryl S-200 และนำไปศึกษาสมบัติการเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดงของโปรตีน และศึกษาการตัดด้วยเอนไซม์ Furin พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสามที่บริสุทธิ์ ไม่สามารถเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดง และไม่สามารถถูกตัดด้วยเอนไซม์ Furin ได้